3月16日，國際學術期刊Nature Metabolism在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心周斌研究組的研究成果。該研究開發了能夠同時示蹤胰島beta細胞和非beta細胞的雙同源重組介導的譜系示蹤新技術。利用該技術研究人員揭示了成體胰島beta細胞的來源，發現在正常穩態及組織損傷情況下成體胰島beta細胞來源于自我增殖，而非干細胞分化。該研究為糖尿病臨床治療研究提供了理論基礎和研究新思路。

胰島beta細胞可以分泌胰島素，具有降低血糖的功能，胰島素和胰島alpha細胞分泌的胰高血糖素協同作用維持體內血糖穩態。糖尿病是一種以高血糖為主要病征的代謝性疾病，具有很多并發癥，包括心臟病發作、中風、腎衰竭、失明和截肢等，已成為嚴重威脅人類健康的一大殺手，造成了巨大的醫療負擔。糖尿病主要包括I型和II型兩種，I型主要由于患者本身的免疫系統缺陷引起的beta細胞選擇性破壞，表現為胰島素缺乏引起的多食多飲多尿，血糖水平升高等。II型糖尿病占總糖尿病患者90%以上，與遺傳、肥胖和缺乏運動等諸多因素有關，多為中年以后發病，相關研究發現該類患者體內胰島仍有產生胰島素的能力，但beta細胞數量顯著少于健康個體，胰島素處于一種缺乏狀態。因此，闡明胰島beta細胞在體內穩態和不同病理狀態下來源，可以為糖尿病的臨床治療提供新的研究方向，具有重要科學意義。

成體哺乳動物胰島中beta細胞的來源目前仍有較大爭議，主要報道了兩種不同的機制：胰島beta細胞的自我復制和由非beta細胞生成新的beta細胞(稱為新生)。關于第一種機制，不同研究組利用遺傳譜系示蹤技術證明了beta細胞自我復制是哺乳動物出生后以及不同損傷條件下產生新beta細胞的主要手段。第二種機制則認為beta可能是通過分化的非beta細胞轉分化或通過胰島干細胞或祖細胞的分化而產生的。

周斌研究組長期致力于新型遺傳譜系示蹤技術的開發與應用，在該項研究中，他們建立了一種可以同時標記胰島beta細胞和非beta細胞的新型雙同源重組介導的譜系示蹤新系統。在研究組前期開發的Dre-rox和Cre-loxP的雙同源重組酶介導的遺傳譜系示蹤技術(He et al., Nature Medicine 2017)基礎上，研究人員突破以往研究模式，不再依賴單一分子標記追蹤某一群細胞分化情況，而是同時且不可逆地區分標記所有beta細胞和其他可能含有潛在干細胞的所有非beta細胞。研究人員使用實驗室構建的正交位點特異性雙同源重組系統Cre-loxP和Dre-rox的交叉型報告小鼠IR1。在IR1報告小鼠中，兩對重組識別位點(rox和loxP)交錯排列，這樣，一次成功的重組可以誘導表達一種遺傳報告基因，并且阻止了另一次重組的發生。該設計可以用兩個不同的永久遺傳標記同時區分標記beta細胞和非beta細胞：tdTomato和ZsGreen。

研究人員首先利用該系統研究了在成體胰腺生理穩態過程中beta細胞的來源，在6周齡大的Ins2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠上誘導Dox1周，然后在3或6個月后分析胰腺組織，組織熒光檢測可以看到整個胰腺組織標記為ZsGreen，中間夾雜著tdTomato陽性信號。通過切片染色發現胰島 beta細胞仍標記為tdTomato，沒有發現ZsGreen陽性的beta細胞，說明在生理穩態條件下，beta細胞主要來自于已有beta細胞的自我復制。

研究人員還構建了胰腺部分切除(partial pancreatectomy, PPX)和妊娠(pregnancy)介導的胰島beta細胞再生模型、胰腺導管結扎(pancreatic duct ligation, PDL)模型、鏈脲佐霉素(streptozotocin, STZ)介導的糖尿病模型等，在這些非遺傳操作損傷模型中均沒有發現ZsGreen陽性的細胞表達胰島素。此外，還構建了新的白喉毒素介導的細胞清除小鼠IR1-DTR，對Ins2-Dre;R26-iCre;IR1-DTR小鼠注射白喉毒素，研究人員發現在清除絕大部分beta細胞(>99%)的情況下，恢復一段時間后可以找到少量ZsGreen陽性的細胞表達胰島素，說明即使非beta細胞貢獻少量胰島素陽性細胞，該系統也可以捕捉到，證明了該示蹤系統的有效性。

Ins2-Dre作為一種持續性重組酶，可能會意外地標記非常罕見的假定干細胞，這些干細胞可能瞬時表達過胰島素。為了避免這種可能存在的情況，周斌組建立了一種可誘導性飽和示蹤的方法(Lineage Tracing at Saturation)。研究人員構建了新的特異性誘導型Ins2-DreER基因敲入小鼠品系和靶向Hipp11(H11)基因座的報告基因工具小鼠H11-rox-tdTomato。在成體階段通過他莫昔芬誘導beta細胞進行遺傳標記( tdTomato)，那么其他非beta細胞為tdTomato陰性。在一段時間之后，如果有tdTomato陰性的非beta貢獻產生新的beta細胞，它們將表達胰島素，因為此時已經沒有他莫昔芬發揮作用而不會被tdTomato標記上。該策略的精確度很大程度上取決于beta細胞誘導標記效率。如果beta細胞標記的飽和度非常接近100%(比如99.9%)，當tdTomato陰性的beta細胞的百分比顯著增加(超過0.1%)，則可以解釋為新的beta細胞產生于干細胞。研究人員利用這個高效且特異的可誘導型beta細胞示蹤系統研究了不同生理病理條件下beta細胞來源，再次證實beta細胞主要來源于已有beta細胞的自我復制。

綜上，該研究的亮點在于開發了一種雙同源重組酶介導的譜系示蹤新技術，來研究成體胰島beta細胞來源。該研究突破了傳統思維模式和技術局限性，可以不依賴于beta細胞干細胞或祖細胞的特定標記，同時且不可逆地區分標記胰島beta細胞和非beta細胞，發現不同生理及損傷狀態下，成體beta細胞產生主要來源于自我復制，而非干細胞分化。新構建的一系列遺傳工具小鼠可以為胰島beta細胞及其他組織器官發育、疾病、再生等研究提供強大的技術支持，該研究成果可以為糖尿病臨床治療提供重要理論基礎和新的研究方向。

周斌研究組博士后趙歡為該論文第一作者，周斌為該論文通訊作者。該工作得到康奈爾大學威爾-康奈爾醫學院教授Qiao Zhou、香港中文大學教授Kathy O. Lui的大力支持。該工作也得到分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術平臺的大力支持，并得到來自中科院、國家自然科學基金委、科技部以及上海市科委等的經費支持。

關鍵詞： 胰島beta細胞來源