科技日報實習(xí)記者 宋迎迎 通訊員 張偉 黃雪年

近日，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所（以下簡稱“青島能源所”）呂雪峰團隊在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)了黃酮生物合成基因簇（BGCs），通過合成途徑解析闡明了真菌黃酮合成新機制，豐富了對黃酮類化合物生物合成的認識，同時為合成生物技術(shù)開發(fā)提供了新的選擇，相關(guān)研究成果在期刊《德國應(yīng)用化學(xué)》上發(fā)表。

(相關(guān)資料圖)

黃酮是廣泛存在于植物中的一大類天然產(chǎn)物，其在功能性食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。目前，黃酮資源依賴于植物中獲得，受制于植物種植周期長、分離純化工藝復(fù)雜等諸多弊端，黃酮產(chǎn)能小、成本高。因此，黃酮類產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)和市場拓展也嚴重受限。利用合成生物技術(shù)設(shè)計構(gòu)建黃酮細胞工廠，推動植物黃酮的微生物高效生產(chǎn)成為一種重要解決方案。由于物種差異，植物黃酮合成途徑在微生物中異源重構(gòu)面臨著適配性差、產(chǎn)量低等問題，距離商業(yè)化仍有較大差距。

真菌黃酮合成示意圖。張偉、黃雪年制圖

利用自抗性基因共定位（SRGD）策略是開展天然產(chǎn)物基因組挖掘的一種有效方式，為了尋找具有抗菌和除草活性的天然產(chǎn)物，青島能源所研究團隊首先以合成支鏈氨基酸的關(guān)鍵酶乙酰乳酸合酶（ALS）為探針，在亮白曲霉中發(fā)現(xiàn)了負責(zé)合成黃酮類化合物氯黃酮的生物合成基因簇。活性評價顯示，氯黃酮具有抑制擬南芥種子萌發(fā)和抑制病原菌生長的活性，而體內(nèi)和體外實驗也證實cfoL確實是編碼ALS的氯黃酮自抗性基因，因此具有開發(fā)成為除草劑和抗生素的潛力。

SRGD策略發(fā)現(xiàn)真菌氯黃酮合成基因簇及活性分析。張偉、黃雪年制圖

青島能源所研究團隊已研究清楚植物黃酮的生物合成途徑。研究人員通過基因敲除、同位素標記實驗發(fā)現(xiàn)，亮白曲霉中查爾酮骨架由NRPS-PKS雜合酶CfoA以苯甲酸或?qū)αu基苯甲酸為起始單元與4分子乙酰輔酶A縮合形成，而非是植物的Ⅲ型PKS裝配模式，說明真菌黃酮骨架合成機制與植物存在顯著差異。

亮白曲霉氯黃酮生物合成途徑。張偉、黃雪年制圖

在此基礎(chǔ)上，研究團隊通過基因敲除和體外酶活實驗發(fā)現(xiàn)，CfoK催化查耳酮關(guān)環(huán)生成黃烷酮，這與植物中的CHI具有相同的功能。但是CfoK與目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CHI存在不同的進化關(guān)系。基于AlphaFold2預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和定點突變實驗表明，CfoK通過His33介導(dǎo)的酸堿催化誘發(fā)查耳酮發(fā)生Oxa-Michael加成反應(yīng)，以6-endo-trig關(guān)環(huán)方式形成構(gòu)型專一的黃烷酮，這一機制不同于植物CHI中水介導(dǎo)的催化過程，因此CfoK是一種新穎的真菌查耳酮異構(gòu)酶。

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真菌中查耳酮異構(gòu)酶CfoK的表征。張偉、黃雪年制圖

亮白曲霉中由黃素依賴型氧化還原酶CfoJ行使黃酮合酶（FNS）功能，將黃烷酮轉(zhuǎn)化為黃酮，進化樹分析顯示，其與已知的FNS I （2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶）和FNS Ⅱ（細胞色素氧化酶P450）處于不同的分支。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和定點突變實驗結(jié)果顯示，CfoJ是通過典型的黃素依賴型氧化還原酶催化機制介導(dǎo)C2-C3位的脫氫，將黃烷酮轉(zhuǎn)化為黃酮，這與植物FNS的自由基催化機制完全不同，因此CfoJ是一種新型的真菌黃酮合酶。

真菌中黃酮合酶CfoJ的表征。張偉、黃雪年制圖

該研究完整解析了真菌黃酮獨特的生物合成途徑，提示真菌黃酮合成途徑在進化上是獨立的，而非通過基因水平轉(zhuǎn)移從植物中獲得。這一發(fā)現(xiàn)豐富了自然界黃酮生物合成的多樣性，同時也為其合成生物技術(shù)開發(fā)與微生物高效制造提供了新思路，對黃酮的應(yīng)用價值開發(fā)具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 生物合成